Opinnäytetyön tiedot

NimiReaaliaikaisen PCR-testin spesifisyys mastiittipatogeenien tunnistuksessa
Tekijä(t)Hietanen Jenni
Tutkintonimikelaboratorioanalyytikko (AMK)
AmmattikorkeakouluHelsingin ammattikorkeakoulu Stadia
Koulutusala(t)tekniikan ja liikenteen ala
Ohjaaja(t)Salmikivi Laura ja Soininen Tiina
Kilpailuvuosi2007, palkittu

Opinnäytetyön tiivistelmä

Lehmien utaretulehdus eli mastiitti on tuotantoeläinten tärkein sairaus. Utaretulehdustapausten hoidosta ja tulehduksen takia käyttökelvottomasta maidosta aiheutuu Suomessa vuosittain useiden miljoonien eurojen kustannukset. Mastiittipatogeenien tunnistamiseen on käytetty perinteisesti maljausmenetelmää, jolloin tunnistaminen tapahtuu bakteeripesäkkeiden morfologian sekä viljelmälle tehtyjen entsymaattisten reaktioiden perusteella. Maljausmenetelmä on erittäin aikaa vievä, jolloin on tunnettu tarvetta nopeamman mastiittitestin kehittämiselle. Molekyylibiologisten menetelmien kuten polymeraasiketjureaktion (PCR) käyttö tauteja aiheuttavien patogeenien tunnistukseen on nykypäivänä hyvin suosittua. Finnzymes Diagnosticsissa onkin kehitelty mastiittipatogeenien identifioimiseen uudenaikainen yhden työpäivän aikana suoritettava PCR-RFLP-analyysi. Tekniikan kehittyessä markkinoille on tullut reaaliaikainen PCR-laite, joka on mahdollistanut mastiittitestin kehittämisen yhä spesifisemmäksi, vähemmän kontaminaatioille alttiiksi, vähemmän työtä vaativaksi ja nopeammaksi. Tämän työn tavoitteena oli selvittää seitsemälle eri mastiittia aiheuttavalle bakteerilajille suunniteltujen qPCR-alukkeiden spesifisyys. Suunniteltujen alukkeiden spesifisyyden testaamiseksi eristettiin bakteeripuhdasviljelmistä DNA:ta Finnzymes Diagnosticsissa kehitetyllä kitillä. Bakteeripuhdasviljelmät olivat peräisin viidestä eri maasta ja ne edustivat useita eri bakteerilajeja. Alukkeet testattiin kaikilla eristetyillä DNA-näytteillä, jolloin voitiin havaita monistavatko alukkeet vain kohdebakteerinsa genomia. Samaiset puhdasviljelmänäytteet oli testattu aiemmin PCR-RFLP-analyysillä, jolloin vertaamalla qPCR-analyysillä saatuja tuloksia PCR-RFLP-analyysillä saatuihin tuloksiin, voitiin määrittää qPCR-analyysin spesifisyys. Alukepareista kuuden voitiin todeta olevan spesifisiä kohteena olevalle bakteerilajille. Yhden alukeparin kohdalla voitiin havaita myös epäspesifistä monistumista. Työn lopputulos oli, että uudelle qPCR-mastiittitestille oli saatu suunniteltua seitsemän lajispesifistä alukeparia.

Avainsanat

DNA-diagnostiikka, qPCR-alukkeet, qPCR-alukkeiden spesifisyys

Sivumäärä

59